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【CMDE】公開人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒審評報告

2018-11-27 5676

體外診斷試劑產品注冊技術審評報告

 產品中文名稱:人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法) 

產品管理類別:三類 6840 

申請人名稱:  廣州市康立明生物科技有限責任公司   

國家食品藥品監督管理總局

醫療器械技術審評中心 

 

基本信息

申請人名稱    廣州市康立明生物科技有限責任公司   

申請人住所廣州市高新技術產業開發區科學城開源大道11號A2棟第六層   

生產地址 廣州市高新技術產業開發區科學城開源大道11號A2棟第六層、A4棟第五層(505單位) 

 產品審評摘要 

一、產品概述

(一)產品主要組成成分

表1:試劑盒組成、規格

具體各組分的主要成分詳見說明書。 

(二)產品預期用途

該產品用于體外定性檢測人糞便樣本中SDC2基因的甲基化情況。 

該產品適用于臨床醫生建議做腸鏡檢查的患者的輔助診斷,不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據,僅作為輔助診斷供臨床醫生參考,提供給患者更多一種大腸癌輔助診斷方法的選擇。臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。

(三)產品包裝規格

10人份/盒、90人份/盒。 

(四)產品檢驗原理

該產品主要包含提取轉化和熒光PCR兩個步驟:提取轉化步驟是用磁珠捕獲的方法提取人糞便樣本中的SDC2基因和ACTB(β-actin)基因;然后用亞硫酸鹽進行轉化未發生甲基化的DNA,發生甲基化的SDC2基因則不會被亞硫酸鹽轉化。 熒光PCR步驟是通過使用雙重熒光PCR的方法在同一個反應孔中檢測甲基化的SDC2基因及ACTB基因保守序列。通過特異性的引物來擴增甲基化的SDC2基因,由FAM標記的熒光探針報告擴增信號,甲基化的SDC2基因作為大腸癌診斷的標志物;通過設計保守區域的引物來擴增ACTB基因,由Texas Red標記的熒光探針報告擴增信號。ACTB基因作為內控基因用來評估樣品DNA是否足量以及樣品DNA質量是否合格。試劑盒中提供陽性質控品、陰性質控品,在每次檢測反應中都需要同時檢測。

二、臨床前研究摘要

(一)主要原材料 

1. 主要原材料的選擇該產品的主要原材料包括:DNA捕獲序列、引物、探針、DNA聚合酶和dNTPs,這些原材料均是通過外購的方式獲得。 DNA捕獲序列、引物以及探針均由申請人自行設計,由合成公司經過合成、修飾和純化后獲得;DNA聚合酶由原材料供應商克隆表達后獲得;dNTPs由供應商化學合成獲得。申請人對主要原材料進行了供應商的選擇,通過功能性實驗篩選出合格供應商,制定了各主要原材料的技術要求和質量標準并經檢驗合格。 

2. 企業參考品和質控品設置情況企業參考品分為SDC2陽性參考品、SDC2陰性參考品、SDC2特異性參考品、SDC2靈敏度參考品和SDC2精密度參考品。質控品分為陽性質控品和陰性質控品。 企業參考品和質控品的制備原料為甲基化SDC2基因比率為100%以及甲基化SDC2基因比率為0%的兩株細胞DNA。兩株細胞經過擴大化培養、DNA提取、超聲破碎、濃度測定和稀釋等過程制備成陰性DNA母液和陽性DNA母液。陰性DNA母液和陽性DNA母液經過甲基化特異性PCR以及測序的方法得到驗證。 SDC2陽性參考品有7種,分別命名為SDC2陽性參考品P1~P7。SDC2陽性參考品P1~P3為一定DNA濃度下不同甲基化SDC2基因比率的樣本;SDC2陽性參考品P4~P7為不同DNA濃度的樣本。 SDC2陰性參考品有8種,分別命名為SDC2陰性參考品N1~N8。SDC2陰性參考品N1~N6為一定DNA濃度下分別含有不同干擾物質的樣本;SDC2陰性參考品N7為一定DNA濃度下含有低于檢測靈敏度的甲基化SDC2基因的樣本;SDC2陰性參考品N8為一定DNA濃度下不含甲基化SDC2基因的樣本。 SDC2特異性參考品1種,命名為SDC2特異性參考品T。SDC2特異性參考品T為一定DNA濃度下含有其他甲基化基因的樣本。 SDC2精密度參考品2種,分別為SDC2精密度參考品J1和SDC2精密度參考品J2。SDC2精密度參考品J1為低濃度的樣本,SDC2精密度參考品J2為高濃度的樣本。 SDC2靈敏度參考品為一定DNA濃度的陰性樣本和陽性樣本的混合,其中陽性的比率為1%。 SDC2陰性質控品和陽性質控品分別為一定濃度的陰性DNA樣本和陽性DNA樣本,用于檢測過程中試劑和儀器的質量控制。此外,每一個反應中均檢測內參基因ACTB,用于結果的判讀及監測樣本的質量。

(二)生產工藝及反應體系研究

申請人對試劑盒反應體系的研究中包括DNA捕獲序列的組合、裂解條件的選擇、MgCl2濃度的確定、dNTPs濃度的確定、引物探針濃度的確定、DNA聚合酶濃度的確定以及陰/陽性質控品濃度等;對PCR過程中的循環數、退火溫度及退火時間進行研究;完成樣本的用量以及樣本保存時間的研究;對該產品適配的兩種儀器Roche LightCycler 480 II以及ABI 7500的檢測結果的判讀的方式和閾值進行了研究。通過功能性實驗,最終確定了最佳的反應體系。申請人根據試劑盒中試劑及組件的主要生產工藝的研究結果,確定了最佳的生產工藝。 

(三)分析性能評估

分析性能評估包括試劑盒外觀、靈敏度、特異性、陰/陽性符合率、精密度以及干擾試驗的研究。在試劑盒外觀的研究中,選擇連續生產的三批次試劑盒,主要針對試劑盒組分是否齊全,包裝外觀清潔、無泄露、無破損,標志、標簽字跡清楚等情況進行目視觀察。結果顯示試劑盒外觀符合質量的要求。靈敏度研究的目的是考察在一定量的野生型的DNA背景下能夠檢測的陽性樣本最低的比例。分析方法是將2ng/μL的陰/陽性細胞株基因組DNA按照6個梯度的方式將兩種細胞株基因組DNA混勻。使用兩種規格(10人份/盒、90人份/盒)六批次試劑盒分別在兩種適配的儀器上進行檢測,確定試劑盒檢測的靈敏度。該靈敏度的研究也同時在糞便樣本為基質的樣本中完成檢測。檢測結果顯示該產品在DNA濃度為2ng/μL的野生型DNA背景下的靈敏度為1%。 特異性研究的方法是分別選取7例經過臨床腸鏡確診為正常人的糞便樣本,選取2例其他基因(BMP3)甲基化的DNA樣本,選取SDC2特異性參考品T,使用兩種規格(10人份/盒、90人份/盒)六批次試劑盒分別在兩種適配的儀器上進行檢測。檢測結果均為甲基化SDC2基因擴增為陰性,說明該產品能夠實現對甲基化SDC2基因的特異性檢測。陰/陽性符合率的研究,陰性符合率中需檢測的樣本類型為包括含有不同類型的可能干擾實驗檢測的常用藥物的樣本、不含有干擾藥物的樣本、含有低于該產品靈敏度的甲基化樣本;陽性符合率的檢測樣本包括固定DNA含量一定且含不同的甲基化陽性DNA比率的樣本、不同的DNA濃度梯度的樣本。使用兩種規格(10人份/盒、90人份/盒)六批次試劑盒分別在兩種適配的儀器上進行檢測。檢測結果的顯示陰性符合率為100%;陽性符合率為100%。 精密度的研究分別選擇低DNA濃度及高DNA濃度的精密度參考品J1和精密度參考品J2。使用兩種規格(10人份/盒、90人份/盒)六批次試劑盒分別在兩種適配的儀器上由兩位實驗人員在20天進行連續的檢測。檢測結果顯示兩種規格的試劑盒在兩種適配儀器上的變異系數均小于等于5%。在干擾試驗中,選擇潛在的干擾物進行研究,包括常用乳液、面霜及女性常用非處方產品,糞便軟化劑、抗腹瀉及瀉藥產品,抗酸及其他胃藥,抗炎癥類藥、止痛藥,動植物DNA,脂肪酸和油脂類物質。實驗結果顯示動物DNA(500ng/ml)、植物組織(500ng/ml)、植物油(10μl/ml)、通便類藥物甘露醇(75mg/ml)、通便靈膠囊(7.25mg/ml)、痔瘡膏(24.75mg/ml)、嗎丁啉(0.14mg/ml)、四環素(10.65mg/ml)、青霉素(2.56mg/ml)、布洛芬膠囊75μg/ml、胃藥斯達舒(6.84mg/ml)、奧美拉唑(2.82mg/ml)、頭孢克肟(20.5mg/ml)、鹽酸左氧氟沙星(0.15mg/ml)、西咪替?。?mg/ml)、感冒靈膠囊(0.27mg/ml)對檢測結果無影響。濃度為3倍正常代謝量(9.23mg/ml)的黃連素對該產品的檢測影響超出允許標準。因此,建議該產品在臨床使用中,受檢者在本檢測取樣前1天避免服用黃連素。 

(四)陽性判斷值

該產品陽性判斷值的研究采用臨床來源糞便樣本。465例中結直腸癌患者120例、腺瘤(≥10mm)76例、腸息肉樣本(<10mm)31例、腸炎樣本24例、胃炎樣本6例、胃癌樣本18例、胃息肉樣本1例,神經內分泌瘤樣本3例、肝癌和腸道脂肪瘤樣本各1例、正常人184例。試驗結果顯示ACTB基因的Ct值在22至40之間,取95%分位值,Ct值≤36時判定為樣本合格。在確定樣本質量合格的情況下,根據臨床對于檢測靈敏度和特異性的需求分析,判定檢測樣本SDC2基因Ct值≤38時判斷為陽性;SDC2基因Ct值>38時判斷為陰性。因此,該產品的陽性判斷值為: ACTB基因的Ct值≤36,甲基化SDC2基因Ct值≤38時判斷樣本為陽性; ACTB基因的Ct值≤36,甲基化SDC2基因Ct值>38時判定為陰性樣本; ACTB基因Ct值>36或者無Ct值時,判定為樣本不合格。 

(五)穩定性 

申請人對該產品的穩定性的研究包括貨架效期穩定性、開封穩定性、反復凍融穩定性、運輸穩定性以及熱穩定性。貨架效期穩定性:選擇三批次試劑盒,定期對規定儲存條件下保存的試劑盒進行檢測,驗證其貨架效期穩定性;并記錄實驗結果和日期,形成報告。其三批次的貨架效期穩定性項目的檢測頻次分別為如下所述: SD11611001:自生產之日起在第一個月、第三個月、第四個月檢之后每個月檢測一次直至第14個月,研究測試劑盒的貨架效期穩定性; SD11612001:自生產之日起每月檢測一次直至第14個月,研究試劑盒的貨架效期穩定性。 SD11612002:自生產之日起每月檢測一次直至第14個月,研究試劑盒的貨架效期穩定性。 對各項參考品及陰/陽性質控品檢測的實驗結果表明:該產品在生產后14個月的產品性能滿足質量的要求,試劑性能穩定。產品有效期可達12個月。 開封穩定性:取一定量的效期內三批次試劑盒,開封使用狀態下放置1天、2天、1周后檢測試劑盒的穩定性。對各項參考品及陰/陽性質控品檢測的實驗結果表明該產品開封使用狀態下放置1天、2天和1周后,其檢測結果顯示試劑盒的產品性能均能夠滿足質量的要求,因此該產品在開封使用條件下存放時間可以達到1周。 反復凍融穩定性:使用三批次試劑盒在規定的儲存條件下,取出試劑盒III反復凍融4次,檢測每次凍融后的試劑盒的穩定性;將試劑盒III放置在冰箱4℃解凍后放回-20℃±5℃保存,反復凍融4次,每次凍融檢測1次。對各項參考品及陰/陽性質控品檢測的實驗結果表明試劑盒III在反復凍融4次的條件下的產品性能均能夠滿足質量的要求。因此聲稱試劑盒III反復凍融不超過4次。 運輸穩定性:使用三批次試劑盒進行冷鏈運輸;對運輸后及運輸后放置到有效期末的試劑盒進行檢測。對各項參考品及陰/陽性質控品檢測的實驗結果表明該產品在冷鏈運輸的條件下運輸6天以及在效期末的檢測結果的各項性能指標均能夠滿足質量的要求。試劑盒的運輸時間在6天內不影響產品質量。 熱穩定性:將三批次試劑盒放置在37℃的鼓風烘箱中,每天檢測一次,連續三天檢測。對各項參考品及陰/陽性質控品檢測的實驗結果表明三批次試劑盒37℃放置3天的測試結果在外觀性狀、陰/陽性符合率、靈敏度、特異性、精密度都滿足質量要求。申請人對糞便樣本保存穩定性以及該產品提取的DNA樣本的保存穩定性進行研究。結果顯示糞便樣本保存時間期限可達8個月;該產品提取的DNA樣本保存時間可達1個月。 

三、臨床評價摘要

申請人在中山大學附屬第六醫院、南方醫科大學南方醫院和山東省腫瘤醫院共3家臨床試驗機構完成了臨床試驗。

采用腸鏡(和)或病理的等臨床診斷結果為對照方法,通過與臨床參考方法對比驗證考核試劑的有效性和安全性,從而評估考核產品的臨床性能。通過采用單盲、對照的試驗設計共篩選入了1381例受試者,有效病例數為1213例。其中結直腸癌病例374例,非結直腸癌病例839例。結直腸癌病例涵蓋了結直腸癌不同分期的患者,占總入組病例數的30.83%(374/1213)。非結直腸癌病例包括干擾人群樣本共551例,其中含437例腸道相關良性疾病人群樣本(主要包括結直腸腺瘤110例、結直腸息肉114例、結直腸炎癥151例、痔瘡47例以及憩室、腫物、大腸黑變病、脂肪瘤等)、59例消化道炎癥或腫瘤人群樣本(主要包括胃癌18例、食管癌12例、胃炎11例、食管炎8例以及肝癌、膽管癌、闌尾惡性腫瘤、胰腺癌、喉鱗癌、十二指腸癌等)、55例其它腫瘤樣本或疾病人群樣本(主要包括黑色素瘤2例、神經內分泌癌5例、乳腺癌4例、微生物消化道感染10例、宮頸癌1例、肺癌6例、肺鱗癌8例、前列腺癌10例、類風濕性關節炎8例以及宮頸鱗癌1例)。另外入組288例腸道正常人群樣本。 將1213例有效病例對照方法結果與考核試劑檢測結果進行比較,檢測結果如下表所示: 

表2:對照方法與考核試劑檢測結果統計四格表  

臨床試驗結果顯示,1213例有效病例中,有77例樣本考評試劑盒檢測結果與對照方法不符,其中假陽性18例(主要集中在腸道相關良性疾病病例,包括息肉6例、腸炎3例、重度異型增生2例以及腺瘤、胃炎等),假陰性59例。對1213例有效病例進行統計分析,結果表明考核試劑對結直腸癌樣本的檢測敏感性為84.22%(315/374),特異性為97.85%(821/839),總符合率為93.65%(1136/1213),Kappa值為0.85。對三家臨床試驗機構入組的374例不同分期結直腸癌患者結果分別進行統計,結果見下表: 

表3:大腸癌臨床分期樣本檢測結果 

由結果可見,在結直腸癌的不同分期,該指標的檢出無顯著差異。 

對77例考核試劑與對照方法不符的樣本和31例臨床試驗中與對照方法符合的樣本(包括腸癌、腸道未見異常、腸炎、痔瘡、息肉、胃癌、食管癌、神經內分泌癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和類分濕性關節炎樣本,覆蓋了入組臨床試驗的各主要樣本病例類型)進行測序,結果顯示測序結果與試劑盒檢測結果一致性為100%,說明該產品能夠實現對SDC2基因甲基化的特異性的檢測。 在臨床試驗中還對40例結直腸癌切除根治術前、后的受試者進行了短期隨訪。使用考核試劑對符合短期隨訪要求的受試者糞便樣本進行檢測,檢測結果顯示39例檢測全為術前與病理結果相符,術后陰性與結直腸癌手術后的結果相符。其中有1例考核試劑檢測結果為樣本不合格。  

綜上所述,考核試劑臨床試驗對該產品的臨床性能進行了較全面研究,臨床試驗符合要求。

四、風險分析及說明書提示 

根據“YY/T 0316-2016 醫療器械風險管理對醫療器械產品的安全風險分析方式,對人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法)進行風險分析。 

(一)受益評估 

根據中國癌癥協會公布的數據:2015年我國大腸癌新發比例約39萬,死亡約19萬,并且呈現逐年快速上升的勢頭。目前大腸癌檢測的金標準為腸鏡檢查,該試劑盒適用于臨床醫生建議做腸鏡檢查的患者的輔助診斷,不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據,僅作為輔助診斷供臨床醫生參考,提供給患者更多一種大腸癌輔助診斷方法的選擇。依據現有臨床試驗結果,對結直腸癌的臨床靈敏度為84.22%,特異性為97.85%。

(二) 風險評估

該試劑盒已知和可預見的安全風險主要有以下幾個方面: 

1. 與生物學危害有關的安全風險,例如糞便樣本可能存在傳染性物質。

 2.與環境有關的危害,例如試劑盒生產及檢驗中的廢液的分類處理問題。

3. 與使用有關的安全風險,例如使用儀器和試劑時沒有按照說明書要求進行操作。

4. 與運輸與儲存有關的安全風險,例如試劑的運輸和儲存超出規定條件。

5. 與預期用途有關的安全風險,例如本產品的檢測結果非唯一診斷依據,醫生未結合其他診斷方法進行綜合診斷。陽性結果不能作為確診依據,陰性結果也不能作為排除的依據。 6. 功能性失效引起的安全風險,例如未按取樣要求取樣、樣本不合格等導致的檢驗失敗。7. 與生產有關的安全風險,例如使用未經過驗證的原材料。 該試劑盒的產品實現的全生命周期中通過對環境的監測、生產的監控、原材料及供應商的管理、半成品及成品的檢驗以及說明書的警示內容等方式對安全風險進行控制和降低,剩余風險可以被控制在驗收準則規定的可接受范圍內,同時沒有帶來新的危害與安全風險。在目前認知水平上,認為該產品上市帶來的獲益/受益大于風險。 

產品說明書中對于安全風險的提示信息如下: 

1. 產品檢測的樣本為糞便樣本,取樣量在1.5g-10g之間。 

2. 患者提供的糞便樣本必須使用廣州市康立明生物科技有限責任公司生產的糞便采集裝置收集,3天內寄送至檢測機構。 

3. 黃連素(9.23mg/ml)對檢測結果有影響,因此患者取樣前1天應注意勿服用藥物黃連素。

4. 樣本的收集、存儲以及DNA的提取和亞硫酸鹽的處理需要按照要求進行,否則可能影響檢測結果導致假陰性和假陽性的發生。 

5. 本檢測試劑盒檢測結果僅供臨床參考不得作為臨床確診的依據,應結合其他臨床診斷結果進行判定。判定為陽性的患者,建議接受結腸鏡檢查以便確診;判定為陰性的患者不排除患病的可能;判定為無效結果的樣本,建議患者重新取樣檢測。  

6. 產品的說明書中同時描述了相關注意事項。              

綜合評價意見

本申報項目為境內第三類醫療器械產品注冊,屬于創新審批項目(編號:201600150)。申請人的注冊申報資料符合現行要求,依據《醫療器械監督管理條例》(國務院令第680號)、《體外診斷試劑注冊管理辦法》(國家食品藥品監督管理總局令2014年第5號)等相關醫療器械法規與配套規章,經系統評價后,建議準予注冊。    

2018年11月8日

 

附件 

人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書 

【產品名稱】 通用名稱:人類SDC2基因甲基化檢測試劑盒(熒光PCR法) 

【包裝規格】 10人份/盒,90人份/盒。 

【預期用途】 本試劑盒用于體外定性檢測人糞便樣本中SDC2基因的甲基化情況。

本試劑盒適用于臨床醫生建議做腸鏡檢查的患者的輔助診斷,不能作為腫瘤早期診斷或確診的依據,僅作為輔助診斷供臨床醫生參考,提供給患者更多一種大腸癌輔助診斷方法的選擇。臨床醫生應結合患者病情及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。

DNA異常的高度甲基化與癌癥的發生發展相關,有研究分析了大腸癌患者的癌組織以及癌旁組織的甲基化情況,篩選出具有顯著差異的甲基化SDC2基因[1]。在糞便樣本的SDC2基因甲基化的研究中發現在特異性為90.9%時,大腸癌的檢測敏感性為90.0%[2]。相對于正常組織,SDC2基因在大腸癌和腺瘤組織中呈現高水平的甲基化現象,并且SDC2基因在大腸癌和腺瘤組織中的表達也顯著高于正常組織[3]。SDC2基因在大腸癌不同分期中呈現高度的甲基化,這一現象預示著其作為大腸癌診斷標志物具有較高的價值[1-3]。 

【檢驗原理】 本試劑盒主要包含提取轉化和熒光PCR兩個步驟:提取轉化步驟是用磁珠捕獲的方法提取人糞便樣本中的SDC2基因和ACTB(β-actin)基因;然后用亞硫酸鹽進行轉化未發生甲基化的DNA,發生甲基化的SDC2基因則不會被亞硫酸鹽轉化。 熒光PCR步驟是通過使用雙重熒光PCR的方法在同一個反應孔中檢測甲基化的SDC2基因及ACTB基因保守序列。通過特異性的引物來擴增甲基化的SDC2基因,由FAM標記的熒光探針報告擴增信號,甲基化的SDC2基因作為大腸癌診斷的標志物;通過設計保守區域的引物來擴增ACTB基因,由Texas Red標記的熒光探針報告擴增信號。ACTB基因作為內控基因用來評估樣品DNA是否足量以及樣品DNA質量是否合格。試劑盒中提供陽性質控品、陰性質控品,在每次檢測反應中都需要同時檢測。

【主要組成成分】 1. 試劑盒中包含的試劑組份 本試劑盒根據試劑不同的保存條件要求,分成如下三個試劑盒:

表1:試劑盒組成、規格及主要成分

注:不同批號試劑盒中的各組分不可以互換。

 2.產品不包含,需自備的試劑和儀器

 儀  器  類:臺式離心機、水浴鍋、磁力架、移液器(規格:10μl、100μl、1000μl、5 ml) 試劑耗材類:實驗需要但試劑盒中不包含的有無水乙醇、10 ml離心管、帶濾芯槍頭(規格:10μl、100μl、1000μl、5 ml)、2 ml離心管、8聯管或者96孔板、96孔板封口膜及壓膜器。 

【儲存條件及有效期】 試劑盒Ⅰ常溫儲存;試劑盒Ⅱ需2℃-8℃密封儲存;試劑盒III 需-20℃±5℃密封儲存。試劑盒有效期為12個月。 試劑盒Ⅲ反復凍融不超過4次,打開包裝后1周內可在2℃-8℃儲存,長期儲存請放置于-20℃±5℃(建議開封后即分裝)。試劑盒Ⅱ、試劑盒Ⅲ運輸過程中需要保持合適溫度,運輸時間不超過6天。 

【適用儀器】 Roche LightCycler 480 Ⅱ、ABI 7500。 注意: 1. 使用ABI7500儀器檢測時探針模式的設置,報告基因:FAM、TexasRed;猝滅基團:NONE;參比熒光:NONE。反應體積為30μl。 2. 使用RocheLightCycler 480 Ⅱ儀器檢測時需要選擇熒光通道:FAM(465-510nm)、Texas Red(533-610nm)。反應體積30μl。 

【樣本要求】 1. 檢測樣本類型:糞便樣本,取樣量在1.5g~10g之間。 2. 患者提供的糞便樣本必須使用廣州市康立明生物科技有限責任公司生產的糞便采集裝置收集,3天內寄送至檢測機構。 3. 檢測機構在收到樣本后建議立刻進行DNA的提取及亞硫酸鹽的處理、熒光PCR的檢測,否則建議將含有樣本保存液的糞便樣本振蕩混勻,凍于-80℃±5℃冰箱,保存期不超過6個月。4. 本試劑盒提取和亞硫酸鹽處理的DNA不適于測定OD260來定量;不適于通過OD260/OD280來判定樣本質量。 5. 提取和亞硫酸鹽處理完的DNA建議立即檢測,否則請于-20℃以下保存,保存時間不要超過1個月。 

【檢驗方法】

1. 核酸提取及轉化工作液的準備   

1.1 90人份工作液的準備   

1.1.1 洗液W2的準備   

*  將100 ml無水乙醇加入洗液W2中,蓋好蓋后上下顛倒6次混勻。在標簽的側面“已加入無水乙醇”的方框“□”內標記“√”號。 

1.1.2 溶液C的準備   

*  將17 ml無水乙醇加入溶液C中,蓋好蓋后上下顛倒6次混勻。在標簽的側面“已加入無水乙醇”的方框“□”內標記“√”號。(注意:該試劑要現配現用,溶液C與無水乙醇的體積比例是1:4)   

1.2 10人份工作液的準備

  1.2.1 洗液W2的準備  

*  將16 ml無水乙醇加入洗液W2中,蓋好蓋后上下顛倒6次混勻。在標簽的側面“已加入無水乙醇”的方框“□”內標記“√”號。 

1.1.2 溶液C的準備   

*  將2.8 ml無水乙醇加入溶液C中,蓋好蓋后上下顛倒6次混勻。在標簽的側面“已加入無水乙醇”的方框“□”內標記“√”號。(注意:該試劑要現配現用,溶液C與無水乙醇的體積比例是1:4) 

2. 糞便核酸提取及轉化   

2.1 糞便樣本、陰性質控品以及陽性質控品的融化   

* 分別將1份陰性質控品、1份陽性質控品和待檢測的糞便樣本置于2~8℃過夜解凍,取出樣本管,擦去管外壁水珠將糞便樣本混合均勻。(注意:樣品解凍后,應立即進行下一步操作)   

2.2 離心   

* 將糞便樣本5000 rpm離心10分鐘。  

* 取9ml上清轉移至新的10 ml離心管中,5000rpm離心10分鐘。   

2.3 過柱   

* 取3.2 ml離心后的懸浮液加入到SPE柱中,5000 rpm離心5分鐘。(剩余的上清可置于-80±5℃保存) 

2.4 棄柱  

* 棄SPE柱內柱。 

* 將解凍的陰性質控品、陽性質控品各3 ml分別加到新的10 ml離心管中。   

2.5 裂解   

* 在樣本、陰性質控品、陽性質控品中分別加入裂解液2 ml,同時加入磁珠M1 50 μl,蓋好蓋后振蕩混勻。(注意:磁珠M1加入前請振蕩混勻,觀察管底無明顯的沉淀物后再加入;磁珠M1與磁珠M2不能混用。)  

2.6 孵育   

* 將離心管放置在干浴器上,95℃孵育15分鐘后取出離心管快速搖勻,室溫(20℃~30℃)條件下靜置1小時。(注意:離心管靜置時應自然降溫,避免快速降溫的因素。)   

2.7 轉移   

* 1500 rpm離心10sec后將離心管置于磁力架5分鐘,吸棄4.2 ml液體,將剩余液體以及磁珠轉移至新的2 ml離心管中。 

* 將離心管渦旋振蕩至肉眼無可見的磁珠團塊,簡短離心后將離心管置于磁力架1-3分鐘,吸棄液體。(注意:渦旋振蕩效果影響實驗的結果,應使磁珠充分分散。)   

2.8 第一次洗滌   

* 加入800μl洗液W1,渦旋振蕩至肉眼無可見的磁珠團塊后簡短離心,將離心管置于干浴器中室溫1300 rpm振蕩孵育1分鐘,簡短離心后將離心管置于磁力架1-3分鐘,吸棄液體。(注意:渦旋振蕩效果影響實驗的結果,應使磁珠充分分散;洗液W1與洗液W2不能混用)  

2.9 轉化

* 加入50μl溶液A渦旋振蕩將管壁磁珠洗下來,簡短離心室溫1300 rpm振蕩20分鐘,簡短離心;將離心管置于磁力架1-3分鐘,使用移液器轉移溶液至新的離心管。   

* 加入100μl溶液B,混勻后簡短離心,干浴器65℃孵育70分鐘后簡短離心。  

2.10 純化  

* 加入450 μl結合液以及50 μl磁珠M2,室溫1300 rpm振蕩孵育15分鐘,簡短離心置于磁力架1分鐘,吸棄液體;再次簡短離心置于磁力架1分鐘,吸棄液體。 (注意:磁珠M2加入前請振蕩混勻,觀察管底無明顯的沉淀物后再加入;磁珠M2與磁珠M1不能混用。)  

2.11 第二次洗滌

  *加入800 μl洗液W2,使用移液器輕輕吹散磁珠,將磁珠轉移至一個新的2ml離心管中。室溫干浴器1300 rpm振蕩混勻1分鐘后簡短離心,置于磁力架1分鐘,吸棄液體。  

2.12 脫磺酸基團   

* 加入200μl已經加入無水乙醇的溶液C室溫1300rpm振蕩孵育15分鐘,簡短離心置于磁力架1分鐘,吸棄液體。   

2.13 第三次洗滌  

* 加入200 μl洗液W2,室溫干浴器1300rpm振蕩混勻1分鐘后置于磁力架1分鐘,簡短離心,吸棄液體。   

2.14第四次洗滌   

* 加入200 μl洗液W2,室溫干浴器1300rpm振蕩混勻1分鐘后簡短離心,置于磁力架1分鐘,吸棄液體。   

2.15 干燥   

* 打開離心管室溫干燥10分鐘。(注意:不要增加干燥溫度和干燥時間,不需要振蕩)   2.16 洗脫   

* 將洗脫液放置在冰盒上自然融化,加入60 μl洗脫液,干浴器65℃,1300rpm孵育10分鐘,簡短離心置于磁力架上1分鐘,將洗脫下來的溶液轉移至新的離心管中,蓋好管蓋并且標記。

3. 擴增試劑準備(PCR反應液配置區) 

3.1 將PCR反應液1以及PCR反應液2插入冰盒中,自然融化。 

3.2 按照以下反應體系加入各種成分。

表2:PCR反應加樣方式 

3.3 加樣完成后,充分混勻后離心,將PCR管放入PCR儀中。 

3.4 按照下面步驟設置PCR的反應條件(下表): 

表3:PCR反應程序 

3.5分析條件設置:Roche LightCycler  480 II儀器結果分析時使用AbsQuant/2nd Derivative Max分析方法分析擴增的循環數;ABI 7500儀器結果分析時使用儀器默認基線,SDS V2.3.1軟件分析時,FAM通道(檢測SDC2基因)值設置為65000,TexasRed通道(檢測ACTB基因)閾值設置為95000。FAM通道和Texas Red通道擴增曲線呈現“S”型擴增才可計算Ct值。 

【陽性判斷值】 本試劑盒檢測臨床樣本,得到465例有效數據中結直腸癌患者120例、腺瘤(≥10mm)76例、腸息肉樣本(<10mm)31例、腸炎樣本24例、胃炎樣本6例、胃癌樣本18例、胃息肉樣本1例,神經內分泌瘤樣本3例、肝癌和腸道脂肪瘤樣本各1例、正常人184例。樣本的ACTB基因的Ct值在22至40之間,取95%分位值,Ct值≤36時判定為樣本質量合格。在陽性判斷值的選擇時根據到臨床的需要,在樣本質量合格的條件下選擇SDC2基因Ct值≤38為陽性結果;SDC2基因Ct值>38時為陰性結果。檢測結果顯示在檢測特異性為92.2%時(248/269)結直腸癌患者的檢測靈敏度為82.25%(99/120),腺瘤患者的檢測靈敏度為47.4%(36/76)。31例息肉樣本檢測結果為4例陽性27例陰性。腸炎患者樣本24例檢測結果為1例陽性23例陰性;胃炎疾病患者樣本6例檢測結果為陰性;胃癌患者樣本18例檢測結果為1例陽性17例陰性;胃息肉1例檢測結果為陰性;肝癌患者樣本1例檢測結果為陰性;腸道脂肪瘤患者樣本1例檢測結果為陰性。神經內分泌瘤樣本3例檢測結果為陰性。 因此,本試劑盒的陽性判斷值為:ACTB基因的Ct值≤36,甲基化SDC2基因Ct值≤38時判斷樣本為陽性;ACTB基因的Ct值≤36,甲基化SDC2基因Ct值>38時判定為陰性樣本;ACTB基因Ct值>36或者無Ct值時,判定為樣本不合格。 

【檢驗結果的解釋】

1. 試驗結束以后運行Ct值的計算,運行無模板對照(NTC)的Ct值≥40或者沒有出現擴增曲線時,說明試驗無污染存在,可以繼續分析試驗情況。 

2. 運行陽性質控品、陰性質控品FAM通道,陽性質控Ct值≤35時,陰性質控Ct值≥40或者無Ct值;Texas Red通道陰性質控品、陽性質控品Ct值均≤35時,說明實驗體系正常,可以繼續分析實驗。 

3. 在檢測樣本反應孔中Texas Red通道,一般Ct值≤36,可以繼續分析,如果Ct值>36則說明樣本DNA量不足或者降解嚴重,不適合實驗分析。 

4. 在檢測樣本反應孔FAM通道中,在沒有出現擴增曲線或者Ct值>38的樣本為陰性。出現S型擴增曲線且Ct值≤38的樣本為陽性。 

5. 判定為陽性的樣本的患者,建議進行腸鏡檢查以確診;判定為陰性的患者不排除患病的可能;判定為樣本不合格的,建議患者重新取樣檢測。 

6. 干擾實驗結果顯示:糞便樣品中分別含有以下物質:動物DNA(500ng/ml)、植物組織(500ng/ml)、植物油(10μl/ml)、通便類藥物甘露醇(75mg/ml)、通便靈膠囊(7.25mg/ml)、痔瘡膏(24.75mg/ml)、嗎丁啉(0.14mg/ml)、四環素(10.65mg/ml)、青霉素(2.56mg/ml)、布洛芬膠囊75μg/ml、胃藥斯達舒(6.84mg/ml)、噢美拉唑(2.82mg/ml)、頭孢克肟(20.5mg/ml)、鹽酸左氧氟沙星(0.15mg/ml)、西咪替?。?mg/ml)、感冒靈膠囊(0.27mg/ml)對檢測結果無影響。 

【檢測方法的局限性】 

1.  本檢測試劑盒僅能檢測使用本公司生產的糞便樣本收集裝置收集的糞便樣本。其他途徑收集的糞便樣本不適用于本試劑盒的檢測。 

2.  樣本的收集、存儲以及DNA的提取和亞硫酸鹽的處理需要按照要求進行,否則可能影響檢測結果導致假陰性和假陽性的發生。 

3.  本檢測試劑盒檢測結果僅供臨床參考不得作為臨床確診的依據,應結合其他臨床診斷結果進行判定。判定為陽性的患者,建議接受結腸鏡檢查以便確診;判定為陰性的患者不排除患病的可能;判定為無效結果的樣本,建議患者重新取樣檢測。

【產品的性能指標】 

1. 外觀: 試劑盒組份齊全;包裝外觀清潔、無泄露、無破損;標志、標簽字跡清楚。

 2.  陰/陽性符合率  

2.1 陰性符合率:檢測8份SDC2陰性參考品(N1~N8),甲基化SDC2基因擴增結果應均為陰性。 

2.2 陽性符合率:檢測7份SDC2陽性參考品(P1~P7),甲基化SDC2基因擴增結果應均為陽性。

 3.  特異性:檢測1份SDC2特異性參考品T,甲基化SDC2基因擴增結果呈陰性。

 4.  靈敏度:檢測SDC2靈敏度參考品L 20次,至少17次甲基化SDC2基因擴增呈陽性。

 5. 精密度:分別檢測SDC2精密度參考品J1、SDC2精密度參考品J2各10次,結果滿足甲基化SDC2基因擴增呈陽性,同時內參基因ACTB擴增曲線正常。計算甲基化SDC2基因以及內參基因ACTB的Ct值的變異系數(CV)均不高于5%。

 6. 在多中心臨床試驗中,對1213例有效病例進行統計分析,結果表明本試劑盒對結直腸癌樣本的檢測敏感性為84.22%(315/374),特異性為97.85%(821/839),總符合率為93.65%(1136/1213),Kappa值為0.85。其中有10例腸癌樣本其SDC2基因38<Ct值≤39,也應引起臨床的重視。 

【注意事項】

1. 本試劑盒僅用于體外診斷,使用前請詳細閱讀說明書并必須嚴格按照說明書進行操作。 2. 應由具備專業經驗或經培訓合格的人員進行操作。

3. 有關實驗室管理規范請嚴格按照行業行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規范執行。

4. 實驗室應按試劑準備區、樣本處理區、反應液配置區、擴增檢測分析區分隔使用。工作流程:操作過程應工作服、帽、鞋、手套等穿戴齊全,各區物品均為專用,不得交叉使用,避免污染。

5. 反應液分裝時應盡量避免產生氣泡,并注意防止泄漏,以免熒光物質污染儀器。

6. 實驗過程中若出現標本及試劑污染工作臺及移液器,應及時用10%次氯酸鈉或75%酒精處理。實驗結束后應立即清潔工作臺,并定期對工作臺及各種實驗用品進行消毒。

7. 不要使用超過有效期的試劑,不同批次的產品不能混用。

8. 加樣所用的加樣器需要定期檢測,保證加樣的準確性

9. 溶液B為亞硫酸鹽溶液,操作時勿接觸皮膚和眼睛;如果接觸到應迅速擦干凈用大量的水沖洗。 

10. 黃連素(9.23mg/ml)對檢測結果有影響,因此患者取樣前1天應注意勿服用藥物黃連素。

11. 為了避免樣本中任何潛在的生物危險,檢測樣本應視為具有傳染性物質,避免接觸到皮膚和粘膜;樣本的處理建議在可防止氣霧外流的生物安全柜中操作,樣本制備區所用過的試管、吸頭需打入盛有消毒劑的容器,并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄;樣本操作和處理均需符合相關法規要求:衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》。

【標識的解釋】

【參考文獻】 

1. Tae Jeong oh, Sungwhan An, Genome-wideidentification and validation of a novel methylation biomarker、SDC2、for blood-based detection of colorectal cancer, The journal ofMolecular Diagnostics, July 2013 vol,15,No.4. 

2. Tae Jeong Oh, et al, Feasibility ofquantifying SDC2 methylation in stool DNA for early detection of colorectalcancer: The Journal of Clinical Epigenetics: 2017. 

3. Niu F, Wen J, Fu X, et al. Stool DNATest of Methylated Syndecan-2 for the Early Detection of ColorectalNeoplasia[J]. Cancer Epidemiology Biomarkers &Prevention,2017,26(9):1411-1419.

【基本信息】

注冊人/生產企業名稱:廣州市康立明生物科技有限責任公司 注

冊人/生產企業住所:廣州高新技術產業開發區科學城開源大道11號A2棟第六層 

售后服務單位名稱:廣州市康立明生物科技有限責任公司 

聯系方式: 020-82510982                

郵 編:510535 

網址:www.creativebio.cn

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生產地址:廣州高新技術產業開發區科學城開源大道11號A2棟第六層、A4棟第五層(505單位)。

生產許可證編號: 

【醫療器械注冊證編號/產品技術要求編號】

【說明書核準及修改日期】